加油囉~掰噗關心您

有阿＠＠可是這樣通常會放大到很多雜七雜八的東西

sweetowen: 恩> <我現在P都是smear!!!!!

第一次產物要稀釋 100~500倍

很常呀~ 例如nested PCR就醫定要這樣做!

不過就像甜甜說的, 一定要稀釋!至少50倍吧~ 第一次的PCR也不用做太多cycle, 大約20~25

如果真的走投無路時也可以把第一次的產物clean up然後定量...XD

謝謝兩位阿，這我卡了1個月了，來試試！

我大四時有經驗XD! 解決方法同上，也是第一次跑的cycle數少，然後要稀釋，不過詳細方法忘得差不多了XD 我已經快兩年沒跑PCR啦~~

常常這樣做..

mrmelancholy: 那你有成功嘛!?我今天做又失敗了QQ

ㄜ 你是同樣的東西跑第二次嗎?
還是有用不同primer

我的做法跟大家一樣阿XD
不怕浪費的話，可以同時再跑一次第一次的PCR
有時候反而會直接有東西orz

我現在的老闆覺得很奇怪.....分生實驗的再現性怎麼這麼差＠＠上星期瞇聽他批評我們幾個再做分生的為什麼沒有把primer dNTP全都都分裝成適用的量每次只取一小管出來退冰 他覺得退冰好幾次哪可能做的出實驗.....

想問大家 大家都有這樣分裝嗎＠＠ 譬如說把 primer分裝成一管5ul 分裝成99管......因為每個反應要加的量實在太少了.....我老闆是化學分析腦袋＠＠

primer 一管50 or 100；dNTP or其他 20 or 50 一管=_=

不過只是為了減少退冰時間=_=

primer我跟你一樣 dNTP我是完全沒分裝啦 他就在那邊質疑我說 你這樣一直重複解凍 當然實驗會做不出來＠＠ 可是明明我做都好好的 是學妹們遇到撞牆期XD

哈哈哈

跟我老闆吵這個永遠講不贏他 他總是要我證明"這樣做真的不會怎樣" 不然就乖乖照他說的方式 有夠歡

更~~~~~~跟我老闆一樣

老實說的確是要這樣...尤其是牽扯到atp之類的東西時~不過我們實驗室也沒在分裝，因為一罐很快就用完了XD

我有把跑完overlap PCR又萃膠後的東西再跑PCR

turtle_han: 我也要將overlap PCR的產物放大!!!那你overlap的部分有多少mer阿~我現在只有35 mer成功率蠻低的...> <

我也大概30個mer左右

overlap後跑膠有預期的片段，但因為萃膠lose的量太多，所以才想說把萃膠後的東西拿去跑PCR後再clean，這樣看剩下的量會不會比較多

turtle_han: 恩恩謝謝> <，我之前沒萃膠較跑還蠻多smear的，因為我一開始兩段DNA的量就不多(180ng與8 ng)就沒萃膠，也是因為一開始量不多才想再放大。那我可以以問你overlap PCR的兩段DNA放多少ng嘛~ 我在想我放的量是不是太少了@@"

太少啦！！ 不過我也忘記要家多少了XD

我是一管20ul,2段模板各下10ng，total PCR體積:200ul，萃完elute 40ul，濃度10幾ng/ul

turtle_han: 好詳細喔!謝謝阿

再DNA濃度很低的情況下要仔細確認DNA是不是確實存在喔

印象中我之前做是兩個片段大小不一樣~所以下的量有一定的比例

UTow: 我兩段DNA大小是不一樣的，我是讓兩個片段的mole數相同，但我我兩段DNA大小差很多，一段135bp另一段4kb................SWEETsweet也因為其中一段太小很難用跑膠的方式確認我這兩段是否有接在一起Orz這也是目前遇到的問題之一

PAGE可以解決 但是要看你願不願意花時間 多135在8% acrylamide gel(19:1 acryl:bis)的電泳可以確定分開 電泳條件為14/cm gel length

*14V/cm 亦即如果你的gel 長度在8公分 就用112V跑40～60分鐘

也還其他我想到的解決發法 不知道適不適用

星號表示4K那段接近尾部大約1k~0.8k位置 如果這個位置附近 能運氣很好的找到一個全序列中唯一且在短片段也不存在的酵素切位

則在overlap PCR後 嘗試放大全長後利用這個限制酵素切割 或許就能分辨 （有疊合的片段應該是會在1k附近 這時0.8%的agarose gel應該是可以觀察出差異)

sweetowen: ,謝謝你阿~我之前也想過用PAGE，可我要萃膠的話是不是就有難度阿，找限制酶切位應該可以喔!謝謝!!!!!!!!